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TRzol LS(液體樣本 RNA 提取試劑)

簡(jiǎn)要描述:

TRzol LS(液體樣本 RNA 提取試劑)公司正在出售的產(chǎn)品:新生隱球菌基因組DNAA431(A-431)人表皮癌細胞6磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6PGDH)測試盒(比色法)牙齦卟啉單胞菌基因組DNAA498人腎癌細胞肌酸激酶(CK)測試盒(比色法)熒光假單胞菌基因組DNAA549 人肺癌細胞 硫氧還蛋白氧化還原酶(TrxR)測試盒(比色法)詹氏乳酸桿菌基因組DNAA549+RF

更新時(shí)間:2024-01-12

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TRzol LS(液體樣本 RNA 提取試劑)

商品屬性:

產(chǎn)品名稱(chēng)

規格貨號
TRzol LS(液體樣本 RNA 提取試劑)50ml×2A-Hc2003

QQ截圖20240110094643.jpg

儲存條件:

TRzol LS 在室溫下能穩定保存 12 個(gè)月。盡管如此,為達到最佳效果,我們建議保存在 2-8°C 的環(huán)境下。

重要提示:

有毒物接觸皮膚或者不慎吞服,會(huì )導致灼傷。一旦接觸皮膚后立即以大量的洗滌劑和清水清洗。若感不適,看醫生并尋求和其他成分的正確治療方案。

產(chǎn)品介紹:

TRzol LS試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細胞時(shí)能保持RNA的完整性。加入氯仿后離心,樣品分成水樣層、中間層和有機層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后,RNA可以通過(guò)異丙醇沉淀來(lái)回收。無(wú)論是人、動(dòng)物、植物還是細菌,該方法對少量及大量的組織和細胞均有較好的分離效果。TRzol LS 試劑操作上的簡(jiǎn)單性允許同

時(shí)處理多個(gè)樣品。所有的操作可以在一小時(shí)內完成。TRzol 抽提的總 RNA 能夠避免DNA 和蛋白的污染,可用于 RNA 印跡分析、斑點(diǎn)雜交、poly(A)+篩選、體外翻譯、RNA 酶保護分析和分子克隆。如果是用于 PCR,當兩條引物位于單一外顯子內時(shí),建議用擴增級的DNase I 來(lái)處理抽提的總RNA。

注意事項:

1.從少量的組織(1~10mg)或細胞(10 2-10 4 個(gè))中分離RNA 樣品:往組織或細胞中加 入 800µl TRzol。待樣品裂解后,加入氯仿并進(jìn)行步驟 2 中的抽提操作。在用異丙醇沉 淀 RNA 之前,加入 5~10μg 無(wú) RNA 酶的glycogen 作為水樣層的載體。為降低其黏度 在加入氯仿前用 26 號注射器抽吸兩次以切斷基因組DNA。Glycogen 會(huì )留在水樣層中 并和 RNA 共析出。在濃縮到 4mg/ml 之前它不會(huì )抑制逆轉錄反應第一鏈的合成也不會(huì ) 抑制 PCR。

2.在勻漿化后和加入氯仿之前,樣品可以在-60℃或者-70℃保存至少一個(gè)月。將 RNA 沉淀溶于 75%的乙醇在 2-8℃至少可以保存一周,在-5—-20℃下至少可保存一年。

3.用 TRzol LS 抽提 RNA 時(shí)要戴手套和護眼罩。避免接觸皮膚和衣服。在化學(xué)通 風(fēng)櫥完成操作。避免呼吸道吸入。如無(wú)例外,室溫保持在 15~30℃的條件下。

自備試劑:

氯仿 、 異丙醇、75%乙醇(RNase-Free water 配制)、RNase-Free water(將水加入 無(wú) RNA 酶的玻璃瓶中,加入 DEPC 至 0.1% (V/V)。放置過(guò)夜并高壓滅菌)。0.5% SDS 溶液(RNase-Free water 配制)(可選)。

操作步驟:

1.樣品預處理 a.生物液體 每0.25ml液體樣品(血清,血漿等等)加入0.75ml TRzol LS,用加樣槍吹打液體樣品 幾次以幫助裂解樣品中細胞。每5~10×10 6個(gè)細胞至少加入0.75ml TRzol LS。對于含有高 污染物樣品如全血樣品,可以用滅菌水按照1:1比例稀釋一倍后開(kāi)始提取。TRzol LS 和液體樣品的終體積比總是3:1。 b.組織 用glass或強力勻漿器攪勻組織樣品,每50~100mg組織或者0.25ml組織懸液加 0.75ml的TRzol LS。一般50~100mg組織體積都要小于0.25ml,如果組織樣品的體積小 于0.25ml,加入滅菌水將組織樣品體積調整到0.25ml以保證體積比例是3:1。 c.單層生長(cháng)的細胞 直接往直徑3.5 cm的培養板中加入0.3ml-0.4ml的TRzol LS溶解細胞,用加樣槍吹打 幫助充分裂解細胞。依據培養板的面積而不是依據細胞的數量來(lái)決定所需的TRzol LS 量 (每10cm2加0.3-0.4ml)。不需要往裂解物里面加水,因為培養板中附著(zhù)殘留的培養液 已經(jīng)充分稀釋了TRzol LS 。 d.懸浮生長(cháng)的細胞 通過(guò)離心來(lái)沉淀細胞。在TRzol LS試劑中用移液管反復吹打來(lái)裂解細胞。每 5~10×10 6的動(dòng)物細胞,植物或酵母菌細胞或每1×10 7細菌加0.75ml的TRzol LS。和步驟 b 一樣用滅菌水調節樣品體積到0.25ml。在加入TRzol LS前應避免洗滌細胞,因為那 樣會(huì )增加mRNA降解的可能性。破裂某些酵母菌和細菌可能需要使用勻漿器。 2.分離階段 將勻漿樣品在15-30°C條件下孵育5min以使核蛋白體分解。每0.75ml TRzol LS 加0.2ml氯仿。蓋緊樣品管蓋,用手用力搖晃試管15秒并將其在室溫下孵育2~15 min。 在2~8°C下以不超過(guò)12,000×g的離心力高速冷凍離心15 min。離心后混合物分成三層: 下層-氯仿層,中間層,上層無(wú)色的水樣層。RNA無(wú)一例外地存在于水樣層當中。 水樣層的容量大約為所加TRzol LS 容量的70%。

2.RNA 的沉淀 將水樣層轉移到一干凈的試管中,如果希望分離DNA和蛋白,有機層和中間層同 樣要予以保留。通過(guò)將水樣層和異丙醇混合來(lái)沉淀RNA。每0.75ml TRzol LS對應0.5ml 異丙醇。將混合的樣品在15-30°C條件下孵育10min并在2~8°C下以不超過(guò)12,000×g的離 心力高速冷凍離心10 min。RNA沉淀在離心前通常不可見(jiàn),離心后會(huì )形成一膠狀片狀 沉淀附著(zhù)于試管壁和管底。

3.RNA 的漂洗 移去上層懸液。用75%的乙醇(RNase-Free water配制)洗滌RNA沉淀一次,每0.75ml 的TRzol LS至少加1ml的75%乙醇。旋渦振蕩混合樣品并在2~8°C下以不超過(guò)7,500×g的 離心力高速冷凍離心5 min。

4.RNA 的再溶解 室溫簡(jiǎn)單干燥 RNA 沉淀,不要在真空管里離心干燥 RNA。尤為重要的是,不能讓 RNA 沉淀干燥那樣會(huì )極大地降低它的可溶性。部分溶解的 RNA 樣品其 OD260 /OD280 比值<1.6 。用移液管分幾次移取 RNase-Free water 或 0.5%SDS 溶液 (RNase-Free water 配制)來(lái)溶解RNA(如果RNA 以后要用于酶切反應時(shí),避免使用SDS。) RNA 還能被 100%甲酰胺(除去離子)再溶解并保存在-70°C。

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PCR基本步驟及注意事項?

一、實(shí)驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,它類(lèi)似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應同樣需要類(lèi)似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列,實(shí)現對特定位置的擴增;PCR Buffer提供一個(gè)反應的緩沖環(huán)境;反應過(guò)程同生物體內一樣,DNA雙鏈打開(kāi),引物結合模板,延伸形成新鏈。而這些過(guò)程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過(guò)控制反應溫度實(shí)現的。如常用94℃變性模板DNA打開(kāi)雙鏈,在退火溫度處引物結合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復重復此過(guò)程即可實(shí)現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開(kāi)始才產(chǎn)生出和靶DNA區段相同的DNA分子,進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區段的指數加倍。

在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來(lái)呈指數擴增的反應變成平坦的曲線(xiàn),產(chǎn)物不再隨循環(huán)數而明顯上升,這稱(chēng)為平臺效應。平臺期(Plateau)會(huì )使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續大量擴增,達到較高水平。因此,應適當調節循環(huán)次數,在平臺期前結束反應, 減少非特異性產(chǎn)物。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物,cDNA等,但不能為RNA。對于不同類(lèi)型的模板,其主要不同在于預變性的時(shí)間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時(shí)間10min足夠,質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產(chǎn)物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過(guò)在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結合,合成另一條鏈。從第二輪開(kāi)始,兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結合,從而實(shí)現了與常規PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴增,原因就在于實(shí)現PCR反應的是DNA聚合酶,只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來(lái)說(shuō),一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜,提取的濃度也往往比較大,為防止濃度過(guò)大對PCR造成影響,故需對提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過(guò)高則可能會(huì )引起非特異性擴增。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結構簡(jiǎn)單,且提取濃度一般較低,則無(wú)需稀釋。

PCR實(shí)驗中應該注意的問(wèn)題有哪些?

沒(méi)有ct值

檢測結果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問(wèn)題:

1、循環(huán)數不夠(一般不超過(guò)45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結束時(shí)或延伸時(shí)采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解??赏ㄟ^(guò)PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過(guò)500ng,根據試劑盒說(shuō)明書(shū)即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質(zhì)的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過(guò)4℃以上也會(huì )影響擴增)。

ct值過(guò)晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會(huì )增大, 但是一般不宜超過(guò)40循環(huán), 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現過(guò)晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實(shí)驗設計和目的進(jìn)行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長(cháng)10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長(cháng)。PCR產(chǎn)物設計超過(guò)500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測或將模板進(jìn)行稀釋。

公司正在出售的產(chǎn)品:

沃氏葡萄球菌基因組DNA5637人膀胱癌細胞輔酶ⅠNAD(H)含量測試盒(比色法)
無(wú)乳鏈球菌基因組DNA8305C人甲狀腺癌細胞8305C(未分化)NAD激酶(NADK)測試盒(比色法)
人葡萄球菌基因組DNA143B 人骨肉瘤細胞乳酸脫氫酶(LDH)測試盒(比色法)
鮑曼不動(dòng)桿菌基因組DNA22RV1人前列腺癌細胞NAD蘋(píng)果酸脫氫酶(NADMDH)測試盒(比色法)
鮑氏志賀氏菌基因組DNA293FT人胚腎細胞NADP蘋(píng)果酸脫氫酶(NADPMDH)測試盒(比色法)
頭葡萄球菌基因組DNA293T人胚腎細胞線(xiàn)粒體呼吸鏈復合體Ⅰ/NADH輔酶Q還原酶測試盒(比色法)
近平滑假絲酵母基因組DNA5-8F人高轉移鼻咽癌細胞系NADH氧化酶(NOX)測試盒(比色法)
單核增生李斯特菌基因組DNA769-P人腎細胞腺癌細胞檸檬酸合酶(CS)測試盒(比色法)
需血斯尼思氏菌基因組DNA786-O[786-0]人腎透明細胞腺癌細胞乙醇含量測試盒(比色法)
雙路普雷沃氏菌基因組DNA95-D人高轉移肺癌細胞 乙醇脫氫酶(ADH)測試盒(比色法)
陰道范妮黑塞氏菌基因組DNAA172人膠質(zhì)母細胞瘤細胞甲醛脫氫酶(FDH)測試盒(比色法)
副流感嗜血桿菌基因組DNAA-204人橫紋肌肉瘤細胞乙醛脫氫酶(ALDH)測試盒(比色法)
格氏李斯特氏菌基因組DNAA2058人黑色素瘤細胞輔酶ⅡNADP(H)含量測試盒(比色法)
陰道加德納氏菌基因組DNAA2780人卵巢癌細胞NADP磷酸酶(NADPase)測試盒(比色法)
巴西曲霉基因組DNAA2780+GFP人卵巢癌細胞+GFP6磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)/葡萄糖6磷酸脫氫酶測試盒(比色法)
光滑假絲酵母基因組DNAA3T淋巴細胞白血病細胞胞漿異檸檬酸脫氫酶(ICDHc)測試盒(比色法)
化膿性鏈球菌基因組DNAA375人惡性黑色素瘤細胞NADP蘋(píng)果酸酶(NADPME)測試盒(比色法)
百日咳鮑特菌基因組DNAA375+EGFP人惡性黑色素瘤細胞+EGFPNAD蘋(píng)果酸酶(NADME)測試盒(比色法)
新生隱球菌基因組DNAA431(A-431)人表皮癌細胞6磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6PGDH)測試盒(比色法)
牙齦卟啉單胞菌基因組DNAA498人腎癌細胞肌酸激酶(CK)測試盒(比色法)
熒光假單胞菌基因組DNAA549 人肺癌細胞 硫氧還蛋白氧化還原酶(TrxR)測試盒(比色法)
詹氏乳酸桿菌基因組DNAA549+RFP 人肺癌細胞+RFP還原酶(GR)測試盒(比色法)
綠膿假單胞菌基因組DNAA549+luc 人肺癌細胞熒光素酶標記還原型(GSH)測試盒(比色法)
加氏乳桿菌基因組DNAA673人橫紋肌瘤細胞氧化型(GSSG)含量測試盒(比色法)
惰性乳桿菌基因組DNAA875人黑色素瘤細胞TRzol LS(液體樣本 RNA 提取試劑)肽過(guò)氧化物酶(GPX)測試盒(比色法)
卷曲乳桿菌基因組DNAAAV-293人胚腎細胞硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶(TPX)測試盒(比色法)
支氣管炎博德特氏菌基因組DNAAC16人心肌細胞S轉移酶(GST)測試盒(比色法)






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