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RNAclean RNA 清潔純化試劑盒

簡(jiǎn)要描述:

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更新時(shí)間:2024-01-12

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RNAclean RNA 清潔純化試劑盒

PCR 反應需要使用哪些試劑和設備?

試劑:
模板DNAPCR反應需要模板DNA,如從細胞、組織、血液中提取DNA等;引物:PCR反應的兩個(gè)引物,分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區域,引物也可以合成為TA克隆等過(guò)程中使用到的引物;dNTPsPCR反應中需要四種dNTPs,包括脫氧腺苷酸(dATP)、脫氧胸苷酸(dCTP)、脫氧鳥(niǎo)苷酸(dGTP)、脫氧胞嘧啶酸(dTTP),用于細胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過(guò)程,用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增;Taq DNA聚合酶:PCR反應需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,還有一些其他種類(lèi)的聚合酶如PFU、Phusion等,用于擴增DNA鏈;PCR buffer溶液:對PCR反應具有緩沖作用,調節反應pH,硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛,可增強PCR反應特異性,從而提高反應效率;酶切體系:PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實(shí)驗步驟,常常需要進(jìn)行酶切操作。MARK:一種分子量標準,用來(lái)判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒:用于純化PCR反應產(chǎn)物;
設備:
PCR儀:用于控制反應溫度,保證PCR反應時(shí)不同溫度環(huán)節的嚴格控制;電泳槽:用于分離PCR擴增產(chǎn)物;核酸提取儀:從組織樣本中全自動(dòng)提取核酸。  這些試劑和設備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是,只有在有序齊全的基礎上,才能進(jìn)行PCR反應并得出準確結果。

公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷!

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產(chǎn)品名稱(chēng)

規格

A-Hc2010

RNAclean RNA 清潔純化試劑盒

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PCR相關(guān)基礎實(shí)驗:

PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由2035個(gè)循環(huán)組成,每個(gè)循環(huán)包括以下3個(gè)步驟:

一、變性:

利用高溫(93-98℃)使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個(gè)循環(huán)之前,通常加熱長(cháng)一些時(shí)間以確保模板和引物分離,僅以單鏈形式存在。該步驟時(shí)間1-2分鐘,接下來(lái)PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段。

二、退火或稱(chēng)接合,復性:

DNA雙鏈分離后,降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時(shí)間1-2分鐘。

三、延伸:

DNA聚合酶由降溫時(shí)結合上的引物開(kāi)始沿著(zhù)DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴(lài)于DNA聚合酶。該步驟時(shí)間依賴(lài)于聚合酶以及需要合成的DNA片段長(cháng)度。傳統的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr(來(lái)自于嗜熱菌Thermus brockianus)約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

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PCR反應條件優(yōu)化:

1、變性溫度和時(shí)間:

保證模板DNA解鏈是保證整個(gè)PCR擴增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s,再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過(guò)高或高溫持續時(shí)間過(guò)長(cháng),可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復性溫度和時(shí)間:

PCR擴增特異性取決于復性過(guò)程中引物與模板的結合。復性溫度越高,產(chǎn)物特異性越高。復性溫度越低,產(chǎn)物特異性越低。需根據引物的Tm值具體設定。

3、延伸溫度和時(shí)間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個(gè)核苷酸時(shí),過(guò)高的延伸溫度不利于引物與模板的結合,可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應時(shí)間,可根據待擴增片段的長(cháng)度而定,小于1kb, 1min足夠;大于1kb需加長(cháng)延伸時(shí)間。Taq酶可根據1kb/min增加時(shí)間。這里需要注意,延伸時(shí)間過(guò)長(cháng)可能出現非特異擴增。因此需要設置恰到好處的延伸時(shí)間。

4、循環(huán)數:

其他參數選定后,PCR循環(huán)次數主要取決于模板DNA的濃度。理論上說(shuō)20?25次循環(huán)后,PCR產(chǎn)物的積累即可達到最大值,實(shí)際操作中由于每步反應的產(chǎn)率不可能達到100%,因此不管模板濃度是多少,20~30次是比較合理的循環(huán)次數。循環(huán)次數越多,非特異擴增增加。

 


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