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ELISA實(shí)驗出現灰區結果分析
點(diǎn)擊次數:48 更新時(shí)間:2024-07-01

         酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)指將可溶性的抗原或抗體結合到聚苯乙烯等固相載體上,利用抗原抗體結合專(zhuān)一性進(jìn)行免疫反應的定性和定量檢測方法。它是應用最多的一種免疫酶技術(shù)。

       ELISA 測定的陽(yáng)性判斷值, 通常是將大量陰性和陽(yáng)性人群的測定數據進(jìn)行統計分析后確定的, 其確定依據為判斷結果的假陽(yáng)性和假陰性率最di。在陽(yáng)性判斷值周?chē)欢ǚ秶鷥戎獾臏y定結果可歸為可疑, 亦即ELISA 測定的“灰區"?!盎覅^"的大小可用統計學(xué)方法確定。測定結果處于“灰區"的樣本, 可通過(guò)確認試驗或追蹤檢測來(lái)確定到底是陽(yáng)性還是陰性ELISA“灰區"是把定量分析的正常值范圍引入定性分析而建立的概念?;覅^的設置有二種: (1)CO × (1±C) , C 為該試劑的批內C (一般在15%~ 20% 間) ; (2)CO ±2S, S 為做室內ROC 的S。

  

        另外, 個(gè)人認為: ELISA“灰區"對于不同項目和應用的領(lǐng)域不同, 其設置不能一概而論。根據美國疾病控制中心 (CDC) 對美國Ortho 的抗HC 檢測的ELISA 試劑盒進(jìn)行研究, 發(fā)現只有檢驗結果S/CO ≥318 時(shí), 高度預示HC 抗體真陽(yáng)性狀態(tài); 若檢驗結果S/CO < 318, 存在較高的假陽(yáng)性。在血站系統的獻血員抗HC 篩查用上述兩種灰區的設置方法沒(méi)有什么不可; 如果臨床實(shí)驗室抗HC 的灰區也按前者設置,勢必存在較多的假陽(yáng)性。ELISA 質(zhì)量保證是一個(gè)復雜的過(guò)程, 許多重要的環(huán)節都影響到檢測的質(zhì)量?,F分析如下。

 

1 、方法學(xué)的影響

 ELISA 測定模式包括以下幾種: 雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、IgM 抗體捕捉法、競爭抑制法, 其中競爭抑制法因受操作時(shí)差所引起的bu 公平競爭等因素的影響, 結果重復性較差, 質(zhì)量較難控制。

 

2 、試劑因素

試劑的選擇 檢測的原理均基于抗原抗體反應。由于該反應過(guò)程受多種因素的影響, 如普遍存在基質(zhì)效應、交叉反應等, 因而檢測結果難以溯源, 不同方法、不同試劑之間甚至同一試劑不同批號間結果均缺乏可比性。試劑質(zhì)量在很大程度上決定了檢測的水平, 因此在引入新項目之前必須對試劑進(jìn)行嚴格的評估。試劑的評估有以下幾個(gè)步驟: (1) 確定開(kāi)展該項目的必要性; (2) 了解該項目現有的檢測方法和原理; (3) 在了解試劑的組成基礎上選擇多家試劑盒進(jìn)行比較,判斷標準shou 選參考方法或參考物質(zhì), 其次為臨床的滿(mǎn)意度及權wei 機構的報告如各級室間質(zhì)量評價(jià)、CDC 報告等; (4) 定期對檢測結果進(jìn)行追蹤反饋直至最終認可該試劑。

 

3、樣本因素

  標本干擾因素包括內源性干擾因素和外源性干擾因素,前者包括類(lèi)風(fēng)濕因子、補體、異嗜性抗體、自身抗體、溶菌酶等, 后者包括標本溶血、標本被污染、標本貯存時(shí)間過(guò)長(cháng)、標本凝固不全、冷凍標本的反復凍融等。其中外源性干擾因素是我們在檢測過(guò)程中可以避免也是必須避免的因素, 而避免內源性因素的干擾則主要通過(guò)選擇合適的試劑盒。在臨床中遇到少見(jiàn)的疑難病例時(shí)應當考慮到內源性干擾因素的存在。以下對外源性干擾因素進(jìn)行簡(jiǎn)要說(shuō)明:

 

       標本溶血要注意避免出現嚴重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團, 其具有類(lèi)過(guò)氧化物的活性, 因此, 在以辣根過(guò)氧化物酶(ho rseradish peroxidase,HRP) 為標記酶的ELISA 測定中, 如果血清標本中血紅蛋白濃度較高, 則其就很容易在溫育過(guò)程中吸附于固相, 從而與后面加入的底物反應顯色。

 

4、操作因素對ELISA 結果的影響

      ELISA 測定一般遵循以下步驟: 固相包被→加樣品→溫育→洗滌→加酶結合物→溫育→洗滌→加底物→溫育→顯色→終止顯色→比色

目前各種形式的ELISA 自動(dòng)分析儀已經(jīng)進(jìn)入市場(chǎng), 如廣泛應用于血站系統的微板式全自動(dòng)酶免分析儀, 其試劑為開(kāi)放式的, 而對于其它類(lèi)型的, 則試劑和儀器往往是配套的。但當前大部分醫學(xué)實(shí)驗室均采用手工操作加儀器測定的方式。ELISA 操作步驟復雜, 操作不當將引起較大的誤差。以下敘述各個(gè)步驟中的影響因素。加樣器是一種比較精密的工具, 其在長(cháng)時(shí)間使用時(shí)會(huì )因機械磨損或者推動(dòng)桿內附著(zhù)血痂等原因造成加樣不準, 尤其是對于樣本量較大的臨床實(shí)驗室, 因此必須定期對加液器進(jìn)行維護和校準。每次加不同的標本時(shí)均需更換吸嘴, 以免發(fā)生交叉污染。加樣時(shí)速度不可太快, 避免將標本加在孔壁上部, 并注意不要濺出或產(chǎn)生氣泡。加樣時(shí)還應當注意操作時(shí)差對結果的影響, 操作時(shí)差是指加入標本、試劑及混勻時(shí)間的差異。操作時(shí)差在每個(gè)實(shí)驗中都存在, 尤其是手工操作, 日常檢測標本多達幾百個(gè),從加入第一個(gè)標本到最后一個(gè)標本, 需幾十分鐘, 加入試劑及混勻等均存在著(zhù)前后時(shí)間差異, 使抗原抗體反應和酶促反應時(shí)間不一致, 操作時(shí)差對競爭法檢測的結果影響更大, 在加酶結合物和底物時(shí)可用定量多道。


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