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ELISA檢測各方法一般操作過(guò)程
點(diǎn)擊次數:111 更新時(shí)間:2024-06-24

     ELISA檢測是一種免疫檢測方法,通常用于測量生物樣品中的抗體或抗原,包括蛋白質(zhì)或糖蛋白。像其他免疫檢測法一樣,它們依靠抗體與目標的結合來(lái)促進(jìn)檢測。

      通常情況下,ELISA檢測是在96孔板中進(jìn)行的,這種形式使其適合于一次篩選許多樣品。血清、血漿、細胞培養上清液、細胞裂解液、唾液、組織裂解液和尿液都是用于這些檢測的常見(jiàn)樣品類(lèi)型,但理論上大多數液體樣品類(lèi)型都可以使用。然而,重要的是要考慮到一些樣品類(lèi)型可能包括抑制性因素,如共享相似抗原表位的緩沖液成分或可能損害目標或檢測成分的蛋白酶等因素,這些因素可能干擾檢測的性能。

      有幾種不同的檢測形式,但都依賴(lài)于目標本身或能夠捕獲目標的抗體/抗原與包被板表面的結合。然后采用測定步驟,包括結合抗原,或常見(jiàn)的抗體,以使成功的結合被測定和量化,常見(jiàn)的是通過(guò)比色測定?,F在有四種主要的ELISA類(lèi)型,直接法、間接法、夾心法和競爭法。

      同樣的原理也適用于抗體的測定,只是抗原和一級抗體的作用相反。雖然不同類(lèi)型的ELISA方案有差異,但大多數檢測都有一些應該考慮一般操作過(guò)程。

1、板包被

大多數ELISA檢測步是將檢測的個(gè)成分與包被板結合。這通常是通過(guò)被動(dòng)吸附完成的,一個(gè)非特異性的過(guò)程,所以結果將取決于涂在包被板上的東西。

如果使用了含有抗原的樣品,那就需要一個(gè)具有選擇性的包被板,因為各種抗原都會(huì )結合,而不僅僅是那些感興趣的。然而,如果像用于抗體檢測的ELISA間接法那樣使用純化抗原,或像ELISA夾心法那樣使用捕獲抗體,那么我們已經(jīng)準備了一個(gè)具有選擇性的包被板。

包被板的類(lèi)型大多數是聚苯乙烯或聚苯乙烯衍生物,其具有不同的結合特性,這取決于目標物質(zhì)和檢測的性質(zhì)。一些目標物質(zhì),包括重度糖基化的蛋白質(zhì)、碳水化合物、DNA、脂類(lèi)、短肽和有洗滌劑的蛋白質(zhì),是不能很好吸附的。在這些情況下,建議使用經(jīng)過(guò)處理允許共價(jià)連接到表面的包被板。

2、孵育

將試劑加入ELISA板后,必須進(jìn)行孵育,以便有時(shí)間進(jìn)行結合或反應。每次孵育的溫度和時(shí)間將取決于檢測步驟和正在進(jìn)行的操作。通常在樣品應用之后,與37℃下孵育1小時(shí)。

然而,像阻斷這樣的步驟可以在冰箱中過(guò)夜,測定過(guò)程中的孵育通常在室溫下進(jìn)行,時(shí)間短得多。

3、洗滌

洗板是在應用在檢測每個(gè)組成部分之間,直到結果測定的一個(gè)重要步驟。溶液從孔中排空后,通常使用磷酸鹽緩沖鹽水-20(PBST)做為緩沖液清洗孔,以去除任何殘留的未結合抗原、抗體或試劑。

這可以用多通道移液器手工完成,或使用自動(dòng)洗板機。

不充分的清洗可能會(huì )導致高背景信號,而過(guò)多的清洗會(huì )導致樣品信號低。不一致的清洗可能會(huì )導致整個(gè)板塊的不一致,從而導致不可靠的結果。

4、阻斷

在用蛋白質(zhì)包被ELISA板后,阻斷通常是必要的,以防止在接下來(lái)方案步驟中測定抗體的任何非特異性結合。

與檢測無(wú)關(guān)的混合蛋白被添加到板中并進(jìn)行孵育,占據任何可用的非特異性結合位點(diǎn)。常見(jiàn)的蛋白質(zhì)阻斷緩沖液選擇包括脫脂干乳、牛血清白蛋白(BSA)和酪蛋白。

另外,非離子洗滌劑,如Tween 20或Triton X-100,可作為阻斷劑使用,但不能像蛋白質(zhì)那樣提供永jiu性阻斷。無(wú)效的板塊阻斷會(huì )導致背景噪音增加,降低檢測的靈敏度和特異性。

5、抗體

實(shí)驗性抗體是大多數ELISAs的基石,選擇正確的抗體至關(guān)重要,特別是在使用多種抗體的情況下。單克隆抗體和多克隆抗體都可以使用,它們都有各自的有點(diǎn)和缺點(diǎn)。單克隆抗體提供高特異性,但成本較高。另一方面,多克隆抗體可以在多個(gè)結合點(diǎn)與目標結合,放大信號并提高靈敏度。

使用采用二級抗體的方法增加了額外的步驟,延長(cháng)了檢測時(shí)間,增加了出錯機會(huì ),需要多優(yōu)化來(lái)找到合適的兼容抗體對。然而,使用多克隆二級抗體所帶來(lái)的靈敏度提高可能使其成為一種值得或必須的有效檢測方法發(fā)展方向。

6、測定

無(wú)論使用哪種ELISA類(lèi)型,后一步都是測定步驟,常見(jiàn)的是利用酶介導的可見(jiàn)顏色變化化學(xué)反應,然后可以用紫外-可見(jiàn)分光光度法測量。

酶結合抗原或抗體被應用到測試孔中,如果目標存在,它就會(huì )與之結合。當酶的適當底物被添加到包被板上時(shí),它會(huì )引起顏色變化,與孔內結合的目標物的數量成正比。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)是一種常用共軛物,一般與底物3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)合作使用。底物在HRP的作用下變成藍色,然后在加入硫酸溶液后變成黃色,停止反應。

然后可以用酶標儀(在TMB加入終止液后,在450nm波段測定),這是一種紫外可見(jiàn)分光光度計,來(lái)確定每個(gè)孔的吸光度值,并根據檢測設計進(jìn)行校正和計算,如減去空白孔平均值、技術(shù)重復平均值或與標準比率計算。


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